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数字化恒温扩增技术实现对禽流感病毒的快速定量检测

来源: 找试剂网 2017-06-02 14:30:45

H5亚型禽流感（如H5N1）是一种全世界范围的人畜共患病，严重威胁着家禽产业以及人类的健康。对禽流感病毒进行及时、定量和亚型检测，是疾病快速诊断和疫情防控的重要基础。中国科学院微生物研究所杜文斌（点击查看介绍）课题组与中国科学院动物研究所何宏轩（点击查看介绍）课题组最近合作开发了一种数字化恒温扩增的方法，实现了对禽流感病毒H5亚型的快速定量检测。

该研究采用了杜文斌课题组先前报道的界面打印液滴生成方法（Cross-interface Emulsification, XiE）（Anal. Chem.,2016, 88, 3171-3177）。其原理是利用稳定流速注射液体的毛细管在油-气界面处固定频率振动，利用在油-气界面表面张力的周期性切割作用，实现均一液滴的制备。通过该方法，可快速连续生成大量皮升至纳升体积微液滴，平铺于96孔板容器底部形成液滴阵列，适合于实现数字化核酸扩增分析。XiE技术不依赖于微加工技术，成本低、操作自动化程度高，对于常规实验室及非专业人士尤为适用。

该研究采用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP），使核酸扩增可以在恒温条件（60-65 °C）下进行，是对传统PCR技术的重要改进，尤其适用于条件欠发达地区以及现场快速检测。数字等温扩增技术，通过XiE系统将反应体系分隔在大量大小均一的液滴中，每一个微液滴即为一个反应单元，基于泊松分布原理，进行独立的单拷贝核酸分子等温扩增，达到对起始模板数量进行精确统计的目的，在准确性、灵敏度和绝对定量（不依赖于标准曲线）方面有了革命性的改进，尤其适用于病毒载量的定量检测。因而，开发适用于禽流感检测的数字LAMP技术具有重要意义。

本研究针对H5亚型的禽流感病毒的快速定量，开展了模型验证和禽流感真实样品的检测。建立了特异性的H5亚型禽流感病毒LAMP检测引物探针，首次验证了数字LAMP用于H5禽流感病毒检测的特异性、灵敏度和线性范围。研究结果表明，数字LAMP与实时荧光定量PCR以及美国伯乐公司的QX200数字PCR系统的检测灵敏度和线性一致，具有良好的特异性和准确性。值得指出的是，相比于数字PCR和荧光定量PCR，数字LAMP表现出更好的抗抑制剂能力（如腐植酸、SDS等），可以保证该方法对没有充分除去污染物的野外或临床样品检测的可靠性。

该课题得到国家重点研发计划的支持(2016YFC0100900)，相关研究成果在线发表在Analytical Chemistry 上。中科院动物研究所何宏轩研究员的博士后胡奕和杜文斌课题组的徐鹏为该文章的共同第一作者。

禽流感病毒化学试剂

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